摘要：依那西普（ETN）(Enbrel)是一种可溶性蛋白，可结合并特异性抑制肿瘤坏死因子（TNF），一种促炎细胞因子。ETN是通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中合成的一种融合蛋白，将完整的人TNFⅡ胞外功能区连接到人IgG1的Fc端。生物制剂的生产，像ETN，需要复杂的工艺流程和产品理解，以及细致的操作控制以维持产品的一致性。本评估的目的是展示ETN药物在生产历程中的一致性。-年期间，我们对ETN药物的三个生产基地中超过的批次进行了多重正交生化分析，包括产品纯度、效价和质量的属性评价。基于产品纯度(疏水相互作用色谱法HPLC评估)、结合活性(ELISA法测与TNF结合)、效价(细胞生物测定法测定对TNF诱导的凋亡的抑制)和质量(N-糖图谱)的关键质量属性，我们发现ETN药物的完整性随着时间始终保持一致。这种一致性是通过对初始生产工艺的三个主要改进来维持的，且这些改进得到了详细的可比性评估的支持，并得到了欧洲药品管理局的批准。对ETN药物所有关键质量属性的检测结果表明，在超18年的时间里，ETN的生产工艺始终保持高度一致，且不影响其安全性和有效性，这一点在ETN治疗多种炎症性疾病的广泛临床试验中得到了证明。引言靶向促炎细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)，已经彻底改变了类风湿关节炎(RA)和其他炎性疾病的治疗。随着年被欧洲药品管理局批准，1依那西普(ETN)(Enbrel)是第一个被欧洲药品管理局批准的用于治疗RA的TNF抑制剂。ETN已经被批准用于治疗其他自身免疫性疾病,2包括斑块性银屑病、银屑病关节炎,强直性脊柱炎,3和非放射学性轴性脊柱关节炎,4多关节型幼年特发性关节炎(JIA)和JIA延伸性少关节炎、点炎症相关的关节炎及牛皮癣关节炎。5ETN是一种二聚融合蛋白，由人类TNF受体(TNFRIIorp75)的胞外结构域，与人类1型免疫球蛋白G(IgG1)的可结晶片段(Fc)相连接组成。ETN可以特异性地抑制TNF并以1:1的比例可逆地与TNF(sTNF和tmTNF)结合。6ETN的Fc部分包含了IgG的CH2和CH3的结构域和铰链区域，但不包含CH1结构域。ETN是一个复杂的蛋白质，共有个氨基酸残基(Mr≈kDa)。它是高度糖基化的，包含N-和O-连接的低聚糖，这些低聚糖可能影响这些糖基化蛋白的结构、活性、信号传递、清除和免疫原性。使用ETN阻断TNF可调节TNF诱导或调节的几种生物反应，包括负责白细胞迁移的粘附分子的表达、细胞因子的血清水平(如IL-6)和金属基质蛋白酶3的血清水平。2在最初的监管批准后，生物制剂生产工艺的修订是药物全生命周期管理的一部分。这些变化的范围从相对较小的改变(例如，原材料供应商的变化)到更重要的改变(例如，引入新的纯化步骤)，7受到严格的、地区特有的规章制度的制约。8根据欧洲公共评估报告(EPAR)从年到年的文件，9对29种治疗性单克隆抗体(mAbs)的授权生产变更进行了回顾，结果显示按风险状态(低、中、高)分类的批准变更的年平均数量为1.8(范围为0-3.71)。这些发现表明这样的变更并不罕见，EMA在评估和确保生物制品生产变更前后的可比性方面具有丰富的经验。8国际协调会议(ICH)准则(ICHQ5E)10规范了这一过程，反映了生物制品制造的复杂性，可比性的证明并不一定意味着变更前后产品的质量属性必须完全一致。然而，它们必须具有高度的可比性，这样，根据已建立的知识和经验体系，就有可能圆满地预测质量属性的任何差异是否会对药物产品(DP)的安全性或有效性产生不利影响。使用多重正交的先进技术分析了每批ETN原料药(DS),以评估质量属性,定义了特性,强度、生物活性(效价和结合活性),纯度(聚集、错误折叠和断裂),杂质(例如,宿主细胞蛋白(HCP)和浸出的蛋白质A),安全性、物理特性和总体质量性状。所有批次放行测试结果必须符合严格的规范。因此，在制造过程中需要精细的控制，以确保在严格的操作范围内进行。用于批放行测试的产品质量参数是根据研发方案选定的，其中包括对工艺的广泛描述，以便于理解工艺性能和后续产品质量概况之间的联系。DS的产品质量概况本质上定义了DP的概况，因为在DP的制造过程中质量属性发生了很小的变化。某些已上市的生物制品在生产变更发生前后，其质量属性的差异程度显然说明了可接受的限度，在此范围内，卫生当局所观察到的差异不会改变临床表现。11辉瑞是Enbrel在欧盟和世界其他地区(不包括美国和加拿大，Amgen是Enbrel的MAH)的市场授权持有人。安进和辉瑞目前都在生产ETN，并有相应的业务系统来确保全球范围内的产品一致性。根据它们的物理化学性质和体外功能生物活性，美国和欧洲产的产品已被证明彼此难以区分，与单一产品一致。12自年以来，ETN的制造一直受到各种工艺变更的影响，其目的是提高生产效率，优化工艺稳健性，或调整用于制造DS的原材料来源。从EMA获得的信息显示在欧盟制造的ETN，总共引入了约20个工艺优化。13在这些改进中，只有三个是重要的工艺修正，每一个变更都由单独的可比性实验来支持，以证明变更前后的产品是有可比性的。通过对所有放行测试结果与变更前的历史正常值进行比较，证明了分析的可比性。分析可比性还包括一些进一步的表征测试，以确认与参考标准的可比性。进一步的表征包括分析初级、次级和三级结构、预期的氨基和碳基末端的异质性、预期的翻译后修饰、聚集、碎片化、分子大小、分子电荷分布以及与多个生物受体(包括目标分子(TNF)和多个Fcγ受体)的结合。对ETNDS制造工艺的三个主要修改是:1)用γ-辐照血清替代未辐照的();2)添加额外的纯化步骤以减少工艺杂质(蛋白A配体)();3)使用无血清细胞培养()。这些变化是为了积极改善制造工艺，而不是因为任何安全信号或担忧而做出的。8生产工艺中的每一项变更都得到合适的可比性支持，包括完整的产品放行和稳定性测试，以及进一步的表征测试和临床研究支持，以满足相关法规要求。为了通过这三个主要的工艺修正来展示产品质量的一致性，我们提供了用于选择分析的数据，这些数据表明了产品的纯度、杂质水平、结合活性、效力和整体的产品质量。结果横跨大约20年的生产，跨越多个地点和规模的制造，并证明了每个工艺修订前后的可比性。结果我们评估了从年到年ETNDS的关键质量属性，这些数据来自3个DS商业生产基地，超过批次。这个评估跨越实现三个主要的工艺修正(工艺B,C,D)原流程(工艺A),以及ETNDP在三个不同的地点制造(表1)。用于常规和进一步表征Enbrel质量属性的测试在表2中列出。表1.Enbrel生产工艺的重要修改工艺地点持续时间批次数量描述A1-原始批准工艺B-与初始工艺相同，但在生产罐中使用了γ辐照的牛血清C3-引入额外的层析柱以提高滤出蛋白A配体的清除率D至今＞0从细胞培养中去除血清，引入成分确定培养基表2.主要的Enbrel质量属性和表征测试参数常规放行检测特性胰蛋白酶水解肽图SDS-Page银染（还原/非还原）强度紫外分光扫描纯度和杂志疏水相互作用色谱(HIC)宿主蛋白(HCP)ELISAProteinAELISASDS-PAGE(Coomassie)扫描密度测定法尺寸排阻高效液相色谱效价生物测定（Bioassay）质量唾液酸受体结合N糖图谱参数进一步表征测试初级结构，分子质量，N和c端非均质性，O型糖链分布胰蛋白酶水解肽图-液相色谱-质谱联用仪完整蛋白的LC-MS分析分子电荷等电点聚焦(IEF)阴离子交换色谱法(AEX)高级结构远圆二色UV近圆二色UV差示扫描量热法聚集和片段变性尺寸排除色谱法(dSE-HPLC)生物活性表面等离子体共振(SPR)的结合亲和力目标分子，FcRn,C1q，多重FcγETNDS生命周期(-)一系列放行测试结果评估关键质量属性，结果根据制造工艺(A-D)如图1a-1d所示。周期的重叠，在此期间Enbrel的生产使用不同的工艺，反映了新增制造地点的调试和许可证颁发时间，同时实现从一个制造工艺到另一个的过渡。这些工艺和生产场所的变更是按照相关卫生部门的要求进行的。纯度(图1a，疏水相互作用色谱[HIC]峰3)、杂质(图1b,HCP)、结合活性(图1c)、基于细胞的效价(图1d)和质量(图2a-c,N-糖图谱)的结果在每个工艺修订中具有高度可比性。通过HIC峰3(图1a)测定的错误折叠和聚集体的相对数量在各工艺变化中是一致的，各变更之间有微小的变化，但各工艺之间的总体水平是相当的。第一个主要的工艺变更涉及到从生产生物反应器中使用牛血清到使用γ-辐照牛血清的转变，以及其他次要的工艺改进(即，从A工艺改为B工艺)，导致ELISA检测HCP杂质水平降低(图1b)。虽然这一工艺变化对整体质量或安全没有影响，但HCP的规格限制随后被降低(从ppm降至60ppm)，以反映更严格的工艺控制(过程B-D)，并符合监管实践。HCP水平的进一步降低以及批次间的可变性可以在向C工艺的过渡中看到，在C工艺中，在生产操作中添加了额外的层析步骤。对于TNF结合活性的关键质量属性(图1c)和抑制TNF诱导的凋亡(图1d)，在整个生产历史和引入各种工艺变更前后，所有批次中这些产品质量属性均在预先规定的限度内。为了支持从细胞培养中去除血清(工艺D)，从工艺开发的角度做出了重大的努力，以确保总碳水化合物的构成没有显著的改变，包括核心-岩藻糖基化结构和唾液酸化结构的相对丰度。中性糖(图2a)、唾液酸化糖(图2b)和核心-岩藻糖基化N链寡糖(图2c)的相对丰度表明，这些属性在向D工艺过渡的过程中没有显著变化。使用放行和表征测试的所有批次的分析结果符合所有规范和接受标准，并且在每个工艺修订之后，在每个案例中都证明了ETNDS变更后的可比性。图1.(a)用HICHPLC测定纯度水平(峰值3:聚集和错误折叠水平);(b)ELISA测定的HCP杂质水平;(c)ELISA法测定的与TNF的结合活性;和(d)Bioassay法测定的效价（抑制TNF引起的凋亡）,批次数据来自ETNDP3个生产厂，根据制造工艺(A–D)(–)DP：药物DS：原料药ELISA：酶联免疫吸附试验ETN：依那西普HIC：疏水相互作用色谱法HCP：宿主细胞蛋白HPLC:高效液相色谱TNF:肿瘤坏死因子。在每个工艺中的每个测试方法中，批次间的微小变化反映了在调查性测试或重复测试中的微小差异。数据(水平线)是中间数(95%置信区间)和四分间距;平均值由正方形符号表示。虚线表示ETNDS的规格限制。图2.(a)中性电荷体相对丰度(峰值1、2/3、4、5);(b)唾液酸的种类(峰值6-9);和(c)核心岩藻糖化(峰1,2/3,5,7，9)N-糖，根据工艺(A-D)。在工艺D实施之后，引入了各个峰值的规范。用于创建统计分析的数据因此与图1中的数据不同。数据(水平线)是中间数(95%置信区间)和四分间距，小短线分别表示上限和下限内的最高和最低数据值。平均值由正方形符号表示。讨论经过超过18年的临床经验，ETNDP已经在三个商业生产地点生产，包括超过批次的DS。与最初的许可相比，制造工艺经历了三次主要的修改，并包含了许多其他更小的工艺变更。这些变更反映了提高产品质量状况或进一步降低外来因素污染风险的计划方案。13严格控制的制造环境，适当验证的设备和工艺，被设计出以确保随着时间的推移，DS和DP在制造中的一致性。14这是通过检验ETNDS所有主要质量属性的结果来证实的,证明所有产品质量参数,包括工艺杂质,结合活性,电荷分布,N-糖,和效价,在批次之间,生产地点间,以及每个计划的工艺修改间保持可比性。这里描述的随着生产工艺的改变，ETNDS始终保持结构的一致性反映在安全性文件中，与批准的产品标签保持一致，15遍及各种炎症性疾病的临床试验中。3例如,在一个非盲扩展中,为完成初始ETN试验，缓解疾病的抗风湿性关节炎药物(DMARD)难治的RA患者，提供了一个机会来继续治疗,严重不良事件率(SAEs),严重感染,癌症,和死亡率每年保持稳定,在8年的ETN服药过程中.16此外，一项长期的前瞻性研究数据(17例患者接受超过10年的治疗)表明，ETN作为一种长期、持续的治疗方法，对早期RA和长期RA患者均有良好的耐受性和疗效(图3);持续长期治疗的风险/收益比保持良好。17从两个大型的多中心5年的前瞻性观察记录结果(从年到年进行)，同样证明了活性的一致性:RADIUS(类风湿关节炎DMARD干预和利用研究)1，其中RA患者需要改变治疗方式;以及RADIUS2，即患者在研究中心开始ETN治疗。18总共有多名患者在RADIUS登记接受了ETN治疗，数据显示，接受ETN治疗的患者中SAEs、严重感染事件和医疗利益事件的发生率与临床试验中观察到的相似，且未随ETN暴露而增加。ETN在治疗斑块型银屑病的有效性，在长期非盲扩展实验到安慰剂对照试验中也得到了证实。19、20接受ETN(50mg一次/周)的患者，银屑病面积和严重性指数(PASI)评分从扩展研究的基线提高到72周。19在对两项三期试验的非盲扩展数据的单独分析中，ETN显示了持续的有效性(基于医师全球评估[PGA]和皮肤病生活质量指数评分)和长达4年的良好安全性。20这一情况也得到5年数据的支持，这些数据来自于上市后的安全监测登记，OBSERVE，21其中根据PGA评分为清晰/接近清晰的患者比例，由基线时的12%上升至第6个月时的51%，并在其后保持相对稳定。本研究在长期的ETN实际使用中，没有观察到新的安全信号。据估计，总计有28,名受试者参与了主办方发起的(辉瑞和安进)临床试验，25,名受试者接受了ETN(未发表的数据)。在各种适应症中使用ETN共有万患者的临床经验(未发表的数据)。在所有这些患者群体中，ETN(不论是否使用甲氨蝶呤)有效地减少了症状、疾病活跃度和残疾，并改善了与健康相关的生活质量，这些益处在长期治疗期间得以持续。3在此期间，对生产工艺(生物制品生命周期中熟悉的7、11和仔细调整的8、10方面)进行了更改，且确保目前对患者可用的ETNDP的疗效、安全性和质量与首次引入时没有什么不同。图3.美国风湿病学会(ACR)反应的持续改善(转载自Weinblatt等人的许可，“SafetyandEfficacyofEtanerceptBeyond10YearsofTherapyinNorthAmericanPatientsWithEarlyandLongstandingRheumatoidArthritis”，《关节炎护理与研究》第63卷(3)，-页，Wiley..年，美国风湿病学会(AmericanCollegeof风湿病学17)。展示了11年早期类风湿关节炎(ERA)患者和长期类风湿关节炎(LRA)患者，达到ACR标准的疾病活动量(ACR20/50/70)较基线改善了20%/50%/70%的百分比。ACR数据报告使用C-reactive蛋白质(CRP)值基于CRP的酶免疫分析法(EIA)(ERA:1–78月,LRA:1–60月),EIA的平均值和新的高灵敏度方法(ERA:84–90月,LRA:66–90月),高灵敏度方法(ERA和LRA:＞96月).每年评估ERA和LRA患者的数量已显示。数据不包括所有时间点的所有患者。材料与方法用于评估产品纯度、杂质水平、结合活性、效力和质量属性的测试方法如下所述。在验证计划的生产工艺变更期间，Enbrel的批次根据现有的参考标准进行测试，该标准源自许可的工艺、历史产品趋势，并在适用的情况下进行并行批次分析。在获得工艺变更许可后，通常会根据生物制品的推荐方法制定新的参考标准。22用HIC高效液相色谱法测定纯度HIC用于评估ETNDS和DP的纯度，以及相关变体的存在程度。该方法用于解决ETN的三种变体，它们在生物活性上不同:峰1主要是缺失变体;峰2为均匀ETN;峰3由错误折叠的变体、聚集体、ETN片段和其他工艺相关的杂质组成。结果以相对峰面积百分比表示。每个样本(5mL;2mg/mL)注入到TSKgelButyl-NPR(Tosoh)(2.5mm)分析柱(4.6mm￡35mm)35℃,连接至HPLC系统。产品相关杂质的分离,使用梯度洗脱超过50分钟，流动相A(硫酸铵(.9克)和无水磷酸氢二钠(28.4g)溶解在毫升色谱用水,使用磷酸调整pH值至7.0并用色谱用水稀释至毫升),和流动相B(无水磷酸氢二钠(28.4g)溶于色谱用水稀释至毫升水,用磷酸调整至pH7.0，用水稀释至毫升)。流速为1.0mL/min，荧光检测色谱(激发波长nm;发射波长nm发射)。蛋白质分子的洗脱是按疏水性增加的顺序进行的，在整个过程中，随着盐浓度的降低，将样品分为HIC峰1、HIC峰2、HIC峰3，分别为相对峰1、相对峰2、相对峰3。酶联免疫吸附(ELISA)测定杂质使用多克隆抗体的标准夹心ELISA对来自DS样品中HCP的量进行了定量，相较于CHO细胞HCP制备的校准曲线，使用空载体(所用的试剂是辉瑞公司的专利)。单位为本实验的特异性单位，样品结果为单位蛋白的ppm值(ngHCP/mg蛋白)。ELISA法测定结合活性受体结合试验采用定量固定化ELISA法。样品和标准品中的ETN(TNFR:Fc)与微板孔中吸附的TNF结合，并使用山羊抗人IgG抗体辣根过氧化物酶结合物(Sigma-Aldrich:#A)进行检测。结合活性是根据校准曲线相对于对照曲线或样品曲线，ED50值的比值来计算的。细胞生物测定法测定药效通过测量ETN样品中和组织细胞性淋巴瘤细胞系U(ATCCNo.CRL-.2)中TNF介导的细胞凋亡（caspase激活）能力，来量化ETN样品的效价。36.0–38.0℃孵化U细胞30–60分钟，在加湿的恒温箱中（CO25%±2%），根据测试的不同稀释比例和ETN的参比试剂,在TNF存在下。然后用caspase-glo3/7分析系统(Promega:#G)在室温下孵育30-60min，导致caspase裂解一个化学发光底物，随后释放一个荧光素酶底物，并产生一个发光信号。所产生的发光与半胱天冬酶的活性成正比。样品的生物活性是根据校准曲线与各对照和测试样品曲线的IC50值的比值来计算的。样品特异性活性结果报告为U/mg。用N-糖图谱测定其质量n-链寡糖是一种翻译后修饰，每个ETN单体有三个位点可以添加n-链寡糖结构。ETN蛋白上的三种n链寡糖中的任意一个都可以是多种不同的种类。九种主要的特征形状在每批都要进行常规测试，必须满足严格的接受范围，以确保工艺的一致性。n-链聚糖经酶解法从蛋白质中分离出不同的中性峰(峰1-5)和唾液酸峰(峰6-9)。每个峰值都控制在指定的范围内。将0.25M磷酸钠、pH7.5(3mL)和50万U/mL肽n-糖苷酶F(2mL)溶液(新英格兰生物抗体:L，从脑膜黄杆菌中纯化，不含蛋白酶和EndoF活性)添加到试验溶液中(4mL，25mg/mL溶液)。混合物在37℃孵化20–24h.释放的N-聚糖标记有2-氨基苯甲酰胺.标记的N-聚糖用水重悬或稀释至mL，通过分析柱(4.6mm×mm)在35℃下由反相HPLC分离(GlycoSepNHPLC柱5.0mm)。采用梯度洗脱分离组分，80-20%流动相B(流动相A，0.5%甲酸[用氨调节pH]);流动相B，乙腈)，流速0.4mL/min。荧光检测监测(激发波长nm;发射波长nm)。n-聚糖经酶切后可分解成各种中性(峰1-5)和唾液酸(峰6-9)。原文来源：

BrianHassettet,al.ManufacturingHistoryofEtanercept(Enbrel?):ConsistencyofProductQualityThroughMajorProcessRevisions.MAbs.Jan;10(1):-.

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